ساخت و تعیین خصوصیت سلول نوترکیب t ۲۹۳hek با بیان بالای ۳tim

مقدمه: گلیکوپروتئین 3tim (3t-cell immunoglobulin and mucin domain) یکی از نشانگرهای سطح سلولی سلول های 1th (1t helper) است که در بسیاری از بیماری های مرتبط با سیستم ایمنی، تغییر بیان دارد. این مطالعه، با هدف بررسی و افزایش بیان پروتئین 3tim در سطح سلول t293 انجام شد. روش ها: کاست بیانی 3tim از روی پلاسمید 67m-2682w-ex با استفاده از پرایمرهای دارای جایگاه آنزیمی nhei و mlui تکثیر و در جایگاه های مربوط در پلاسمید phygro ساب کلون شد. پلاسمید نوترکیب محتوی ژن 3tim (3ph-tim) پس از استخراج و خالص سازی، با آنزیم nhei خطی شد و در سلول های t293 با استفاده از روش کلسیم فسفات ترانسفکت شد. سپس سلول های نوترکیب t293 بیان کننده ی 3tim در محیط حاوی هیگرومایسین انتخاب مثبت شدند. پس از یک ماه بر روی dna ژنومیک کلون های سلولی باقی مانده، واکنش pcr (polymerase chain reaction) به منظور بررسی ادغام 3cdnatim (complementary dna) در ژنوم سلول t293 انجام شد. همچنین میزان بیان پروتئین 3tim در سطح سلول به روش فلوسایتومتری ارزیابی گردید. یافته ها: نتایج هضم آنزیمی با آنزیم های nhei و mlui بر روی پلاسمید 3p-h-tim باند 2312 و 4600 جفت بازی را نشان داد که تأیید کننده ی صحت کلونینگ است. در واکنش pcr بر روی dna ژنومیک، باند 1100 جفت بازی تکثیر شد که نشانه ی ورود ژن 3tim در ژنوم سلول t293 می باشد. همچنین در فلوسایتومتری، 88 درصد سلول ها از نظر بیان 3tim مثبت بودند و شدت بیان در قسمت زیادی از سلول ها بالا بود. نتیجه گیری: بیان پروتئین در سیستم های بیانی پروکاریوت ها از نظر زمان و هزینه بهتر از سیستم های یوکاریوتی است، اما در مورد پروتئین های دارای تغییرات پس از ترجمه، این سیستم بیانی جوابگو نیست. در برخی موارد ساختار فضایی طبیعی پروتئین در موقع لنگر انداختن بر سطح غشا، در تولید پروتئین های غشایی مانند 3tim در سیستم های یوکاریوتی، حفظ نمی شود. در نتیجه، برای استفاده در تحقیقات تهیه ی آنتی بادی هایی که اپی توپ های فضایی را می شناسند و یا انتخاب آپتامر، مناسب نمی باشند. بیان پروتئین 3tim در سطح سلول، می تواند ارایه دهنده ی پروتئین با ساختار فضایی طبیعی در پروژه های تولید آنتی بادی، نانوبادی و آپتامر باشد. واژگان کلیدی: 3t-cell immunoglobulin and mucin domain ، t293، سلول نوترکیب